Evaluation of SARS-CoV-2 Molecular Test Using Saliva and Anterior Nasal Swab Samples Compared with Conventional Nasopharyngeal Swab Samples

Background: As the global pandemic of severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 continues, so does the need for molecular tests with simple, painless, and easy sample collection. We aimed to investigate the potential use of saliva and anterior nasal swab samples as a noninvasive and self-collectable specimen for the molecular diagnosis of coronavirus disease 2019 (COVID-19). 
Methods: We prospectively collected the saliva, anterior nasal swab, and conventional nasopharyngeal swab samples at the same time of patients hospitalized in a public hospital from March 2021 to September 2021. Patients were assessed for symptoms, and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed on the samples. The results and cyclethresholds (Ct) of the three sample types were compared. 
Results: Three types of samples per patient were collected, and a total of 135 samples were collected. The mean age of the patients was 39.5 years (range, 9–71 years). The positive rates were 82.2% for nasopharyngeal swab samples, 35.6% for anterior nasal swab samples, and 55.6% for saliva samples. No significant differences in the Ct values between samples (P=0.256) were observed when comparing only the sets which were positive in all three sample types. Using nasopharyngeal swab RT-PCR as the reference standard, the sensitivity and specificity of the combined saliva and anterior nasal swab RT-PCR were 70.3% and 62.5%, respectively. 
Conclusions: Saliva and anterior nasal swab samples could not be used as alternative samples for COVID-19 diagnosis. Further studies with a larger number of patients are needed in the future.

Keywords: SARS-CoV-2, COVID-19, Real-time polymerase chain reaction, Nasopharyngeal swab, Saliva, Anterior nasal swab

서론

 

Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2)는 2019년 처음 중국 우한지역에서 발견된 이후 전 세계적인 유행을 일으키고 있다[1]. 2021년 12월 현재 전 세계적으로 코로나바이러스감염증(coronavirus disease 2019, COVID-19) 발병은 2억 7천만 명에 이르고 누적 사망은 500만 건을 넘어섰다[2]. 국내의 경우 2020년 1월 첫 감염이 발생한 이후 68만 명 이상의 누적확진자 수가 발생했고 사망자 수는 6,000명 이상을 기록하고 있다[3]. COVID-19 진단에는 real-time polymerase chain reaction (RT-PCR)을 이용하여 바이러스의 존재를 입증하는 것이 필요한데, 확진자 수가 증가함에 따라 검사 건수도 크게 증가하고 있다[4]. 의료기관이나 선별진료소에서 COVID-19를 진단하기 위한 RT-PCR 검사에 주로 사용되는 검체는 비인두도말이다. 이를 채취하기 위해서는 의료진이 스왑을 콧구멍 속으로 깊숙이 넣어야 하기 때문에 환자에게 불편감이 있다. 또한 의료인력의 부족과 의료인의 감염위험이 있고, 검체를 채취하기 위해 검사대상자가 의료기관 혹은 선별진료소를 방문해야 하기 때문에 의료기관을 오가며 발생하는 노출과 시간 낭비도 무시할 수 없는 수준이며, 이에 환자가 스스로 채취할 수 있는 검체의 필요성이 대두된다. 상기도 검체에는 비인두도말 외에도 타액과 전비강도말이 포함된다. 비인두도말과 달리 타액이나 전비강도말은 검사대상자 본인이 자택에서 손쉽게 얻을 수 있는 검체이다. 그렇기 때문에 이 검체들을 COVID-19 진단에 사용할 수 있다면 의료인력이 검체 채취 이외의 다른 업무를 할 수 있게 되어 의료자원이 효율적으로 배분이 될 것이며 환자의 불편감이나 타인의 감염위험성 등 검체 채취에서 발생하는 불편함을 없앨 수 있다. 실제로 급증한 환자 수에 대응하여 2021년 4월 미국 Centers for Disease Control and Prevention (CDC)에서는 전비강도말을 SARS-CoV-2 검사에 사용하도록 하며 현재도 검사에 사용하고 있으며[5], 유럽 CDC에서는 2021년 5월 발표한 정보에서 COVID-19 진단검사에 타액을 사용하도록 허용하고 있다[6]. 이는 비록 비인두도말 검체가 가장 높은 민감도를 보이며 COVID-19 진단검사용 검체의 표준이지만, 바이러스의 양이 많은 경우에 비침습적이어서 개인이 수행할 수 있다는 판단에 급증한 검사량을 소화하기 위해 전비강도말을 허용한 것이다[6]. 이 연구에서는 실제로 환자가 자가채취를 시행했을 때 전비강도말과 타액 검체가 비인두도말을 대체할 수 있는지 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

 

1. 검체

2021년 3월부터 2021년 9월까지 경기도의료원파주병원에 입원 중인 COVID-19 환자들로부터 검체를 채취하도록 하였다. 경기도의료원파주병원은 2020년 초기부터 코로나전담병원으로 중증 코로나 환자들을 입원치료하고 있다. 검체는 한 환자에서 비인두도말, 전비강도말, 그리고 타액을 같은 시점에 채취하도록 하며, 비인두도말과 전비강도말은 좌, 우측 콧구멍 중 동일한 콧구멍을 통하여 채취하도록 안내하였다. 검체 채취는 비인두도말은 의료진이, 전비강도말과 타액은 환자가 직접 채취하도록 하였으며 올바른 검체 채취가 이루어질 수 있도록 그림을 포함하여 쉽게 작성된 검체 채취 안내문을 환자에게 배부하였다. 비인두도말과 전비강도말은 clinical virus transport medium (Noble Biosciences, Hwaseoung, Korea)을 이용하여 채취하였으며 타액은 Saliva Collection Kit (Bioneer, Daejeon, Korea)을 이용하여 채취하였다.

이 연구는 인제대학교 일산백병원 임상연구윤리센터(institutional review board, IRB)의 승인을 받은 후 시행하였다(IRB 승인번호: ISPAIK 2021-01-005-006).

2. 분자 검사 및 분석

채취한 검체는 일산백병원 진단검사의학과에서 SARS-CoV-2 정성 real-time PCR을 시행하였다. 핵산추출은 ExiPrep 48 Dx (Bioneer)를 이용하여 이루어졌다. 검사시약은 SD 바이오센서의 STANDARD M nCoV Real-Time Detection Kit (SD Biosensor, Suwon, Korea)를 사용하였으며, real-time PCR은 Bio-Rad CFX 96 Real-Time Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하였다. 검사방법은 제조사의 지침을 따랐다. STANDARD M nCoV Real-Time Detection Kit (SD Biosensor)는 SARS-CoV-2의 E gene과 rdrp gene을 표적으로 COVID-19 정성검사를 위해 개발된 제품이다.

세 종류의 검체를 나란히 검사한 후, 검체 종류별로 양성률과 cycle threshold (Ct)를 확인하였고 세 검체 모두 양성인 세트에서의 Ct값이 유의한 차이가 있는지 분석하였다. 전비강도말 또는 타액 결과 중 하나 이상에서 양성인 경우를 ‘종합양성’이라고 판정하였을 때의 비인두도말과의 결과를 비인두도말을 기준으로 하여 비교하였다. 또한 증상 유무에 따른 양성률을 분석하였다.

3. 통계

양성 검체에서 검체 간 Ct값 차이를 확인하기 위한 통계분석은 PASW SPSS ver. 18.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)의 reliability test(신뢰도 분석)을 이용하였다. 통계적으로 유의한 상관관계는 P<0.05로 정의하였다.

결과

 

1. 대상 환자

2021년 3월부터 2021년 9월까지 45명의 환자가 참여하였다. 각 환자별로 비인두도말, 전비강도말, 타액 세 검체를 동시에 채취하여 총 검체 수는 135개였다. 대상 환자의 평균 나이는 39.5±15.5세였으며, 9세부터 71세까지 분포하였다. 이 중 18세 미만은 2명 포함되었다. 검체 채취 시점에 증상이 있었던 환자는 5명이고 나머지 40명은 증상이 없었다.

2. 검체별 양성률과 Ct값

양성률은 비인두도말 82.2% (37/45), 전비강도말 35.6% (16/45), 타액 55.6% (25/45)였다(Table 1). 비인두도말에서 Ct값이 가장 낮아 E gene과 rdrp gene의 Ct값 평균이 각각 29.16±4.60, 29.53±4.74였고, 전비강도말은 30.08±4.08과 30.10±4.04, 타액은 31.17±4.43과 31.35±4.37로 가장 높았다(Table 1). 세 검체 모두에서 양성을 보인 경우는 12명이었고 검체별 Ct값은 유의한 차이가 없었다(P=0.256) (Fig. 1).

Table 1 . Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 positive rates and Ct values for nasopharyngeal swab, anterior nasal swab, and saliva samples.

Specimen typeNo. of positive specimen (%)CtE geneRdrp gene

Nasopharyngeal swab	37/45 (82.2)	29.16±4.60	29.53±4.74
Anterior nasal swab	16/45 (35.6)	30.08±4.08	30.10±4.04
Saliva	25/45 (55.6)	31.17±4.43	31.35±4.37

Values are presented as number (%) or mean±standard deviation..

Abbreviation: Ct, cycle threshold..

Figure 1. Cycle threshold values of the 12 sets of specimens that are all positive. Values are presented as mean±standard deviation. Abbreviations: NP, nasopharyngeal swab; AN, anterior nasal swab; SA, saliva. 

3. 비인두도말과 전비강도말, 타액을 합한 결과 비교

전비강도말과 타액 모두 양성인 경우는 12명이었고 전비강도말만 양성인 경우는 4명, 타액만 양성인 경우는 13명으로, 두 검체 중 하나 이상에서 양성인 경우(종합양성)은 총 29명이었다. 비인두도말에서 양성인 검체인 37검체와 종합양성 검체를 비교한 결과는 Table 2와 같다. 비인두도말 결과를 기준으로 종합양성 검체의 민감도는 70.3% (26/37), 특이도는 62.5% (5/8), 양성예측도 89.7% (26/29), 음성예측도 31.3% (5/16)이었다. 두 검체군 결과 간의 일치율은 68.9% (31/45)였다.

Table 2 . Comparison of the results of combined anterior nasal swab and saliva samples with those of nasopharyngeal swab samples.

Anterior nasal swab and salivaTotalPositiveNegative

Nasopharyngeal swab
Positive	26	11	37
Negative	3	5	8
Total	29	16	45

4. 증상 유무에 따른 양성률

검체를 채취한 시점에 증상이 있었던 환자는 5명, 증상이 없었던 환자는 40명이었다. 증상이 있던 5명의 환자에서 검체별 양성률은 비인두도말 40% (2/5), 전비강도말 20% (1/5), 타액 20% (1/5)였다. 증상이 없었던 40명의 환자에서 검체별 양성률은 비인두도말 87.5% (35/40), 전비강도말 37.5% (15/40), 그리고 타액 60.0% (24/40)이었다(Table 3). 양성 검체 수가 다섯 건으로 적어 통계적 분석을 진행하지는 못하였으나 양성 결과를 보인 검체에서의 Ct값은 증상이 있는 경우보다 증상이 없는 경우 비인두도말, 전비강도말, 타액 세 검체 모두에서 더 낮았다(Table 3).

Table 3 . Ct values and positive rates of SARS-CoV-2 test results according to the presence of symptoms by specimen type.

SpecimenSymptom positiveSymptom negativeCt valuePositive rateCt valuePositive rateERdrpERdrp

Nasopharyngeal swab	32.91	33.57	40.0% (2/5)		28.95	29.30	87.5% (35/40)
Anterior nasal swab	32.90	32.93	20.0% (1/5)		29.90	29.91	37.5% (15/40)
Saliva	33.40	33.60	20.0% (1/5)		31.08	31.26	60.0% (24/40)

Values are presented as mean or % (number)..

Abbreviations: Ct, cycle threshold; SARS-CoV-2, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2..

고찰

 

이 연구에서는 실제 환자들이 자가채취한 타액과 전비강도말 검체 두 종류를 동일한 시점에 의료진이 채취한 비인두도말과 PCR 결과를 비교하였다. 환자들에게 검체 용기와 함께 검체 채취 안내문을 전달해서 타액과 전비강도말 검체의 자가 검체 채취가 어려움 없이 진행되었다. 9세의 어린이 환자도 있었으나 스스로 안내문을 읽고 성공적으로 검체를 채취하였다. 현재 코로나의 대유행으로 전 세계적으로 의료인력이 부족한 상황에서 타액이나 전비강도말이 기존의 비인두도말을 대체할 수 있는지에 대한 연구결과가 발표되었다[7-13].

이들 중 대다수의 연구는 다음과 같이 타액에 관한 연구이다. 2020년 New England Journal of Medicine에서 발표된 논문에서는 70명의 입원환자를 대상으로 했을 때 비인두도말보다 타액에서 바이러스 RNA 양이 오히려 더 많았고 진단 후 10일 후의 양성률이 더 높았다는 결과로 타액이 SARS-CoV-2 진단에 있어서 비인두도말과 최소한 비슷하거나 높은 민감도를 가질 것이라는 결론을 냈다[14]. 그 외에도 타액 검체가 비슷한 바이러스 RNA 양을 가지고 있어 비인두도말 검체와 견주었을 때 믿을 만하다는 연구들이 대부분이다[7-10].

이 연구결과에서 전비강도말은 가장 낮은 양성률을 보였으며 타액보다 낮은 양성률을 나타냈다. 이는 앞선 연구와도 일치하는데, 타액이 비인두도말과 비슷한 정도의 양성률을 나타낸다고 한 연구에서도 전비강도말은 타액, 비인두도말에 비해 양성률이 낮았다[11]. SARS-CoV-2 검사에서의 전비강도말 검체에 대한 논문 12편을 분석한 메타분석에서는 전비강도말 검체의 민감도가 비인두도말 검체에 비해 전반적으로 낮게 나타났다[12]. 이 논문에서는 자가채취가 가능하고 의료인력이 필요하지 않기 때문에 더 많은 수의 검사가 가능해지기 때문에 낮은 민감도를 극복할 수 있을 것이라는 결론을 내렸다. 수가 적지만 전비강도말이 비인두도말을 대체할 수 있을 것이라는 연구도 있었다[13]. 하지만 이들 연구에서는 동일한 집단을 대상으로 하지 않았고 동등하다는 근거도 internal control의 Ct값을 주된 근거로 사용했기 때문에 실제 임상에 적용하기에는 근거가 부족하다. 반면, 우리 연구는 동일한 환자에서 양성 타겟 유전자를 대상으로 비교함으로써 실제 임상현장과 더 유사한 환경에서의 연구였다.

SARS-CoV-2 양성률은 비인두도말, 타액, 전비강도말 순서로 전비강도말이 가장 낮았으며, Ct값은 비인두도말이 가장 낮고, 그 다음 전비강도말, 타액 순서였다(Table 1). 통계적으로 유의하지는 않았지만 실제 검사에서 사용하는 검체인 비인두도말이 가장 민감한 결과를 보이는 경향성을 확인할 수 있었다. 이 연구에서는 비인두도말에서의 Ct값이 가장 낮긴 했으나 검체 수가 많지 않아 통계적으로 증명하지는 못하였다. 하지만 외국의 연구들에서는 비인두도말에서 타액에 비해 유의하게 Ct값이 낮았다는 보고가 있어[15,16], 민감도 측면에서는 비인두도말이 가장 우수할 것으로 여겨진다. 특히 우리 연구에서 전비강도말 또는 타액 검체 중 하나라도 결과가 양성인 경우 환자 단위에서 양성으로 정의했을 때에도 위음성률이 30%여서 COVID-19의 진단목적으로 비인두도말을 대체하기에 부적절했다. 위음성의 문제 이외에도, 두 검체를 모두 검사하게 하는 경우 검사비가 두 배로 필요하여 의료비용과 검사인력 필요의 증가로 이어진다.

이번 연구에서는 대부분 검체의 Ct값이 20대 후반에서 30대 초반까지로 바이러스의 양이 적은 약양성의 검체들이 대부분을 이루었다. 만약 증상 발현 초기의 강양성 검체들이 주로 포함되었다면 세 종류의 검체 모두 양성을 보일 가능성이 높아지고, 그렇다면 양성률이 전부 높아지기 때문에 세 종류 검체의 성능을 비교하기 어려웠을 것이다. 이 연구에서는 약양성의 검체들이 다수 포함되어 동일한 환자에서도 검체마다 양성과 음성으로 결과가 다른 경우가 많아 검체 간 양성률을 더 예민하게 비교할 수 있어 연구의 강점으로 작용하였다.

환자들의 정보를 조사할 때 확진일로부터 검체 채취까지의 시간을 조사하지 않았던 것은 이 연구의 한계점이다. 분석결과 모든 검체에서 Ct값이 전반적으로 높았는데, 그 이유에 대해서 환자들이 의료기관에 입소한지 이미 며칠 이상 경과하여 바이러스 농도가 낮아지고 있는 시점이기 때문일 것이라고 예상만 할 수 있었다.

이 연구는 동일 시점에 COVID-19 환자들에게서 세 종류의 검체를 얻어 검체별로 결과를 비교한 연구로, 의료진의 개입 없이 타액과 전비강도말 검체를 환자에게 얻게 하여 실제 적용상황과 가장 유사하다는 데 의의가 있다. 전비강도말과 타액 검체를 함께 검사한다고 해도 민감도가 낮아 정확한 진단이 필요한 시점에서는 비인두도말을 대체하기에 부족하다고 판단되었다.